Qiagen 51304 基因組DNA小提試劑盒科研應(yīng)用指南

——高效、高純度基因組DNA提取的標(biāo)準(zhǔn)化解決方案

一、產(chǎn)品原理與核心優(yōu)勢(shì)

1.1 技術(shù)原理

硅膠膜離心柱技術(shù)：

選擇性結(jié)合DNA（>100 bp），高效去除蛋白質(zhì)、RNA及小分子污染物

基于pH調(diào)控的吸附/洗脫機(jī)制（裂解液pH=8.0，洗脫液pH=8.5）

關(guān)鍵步驟：

細(xì)胞裂解（蛋白酶K+Buffer ATL）

核酸吸附（Buffer AL+乙醇）

雜質(zhì)去除（Buffer AW1/AW2洗滌）

DNA洗脫（Buffer AE或水）

1.2 性能參數(shù)

指標(biāo) Qiagen 51304 傳統(tǒng)酚-氯仿法

得率（哺乳動(dòng)物細(xì)胞） 5-10 μg/10? cells 3-8 μg/10? cells

A260/A280 1.7-1.9 1.6-1.8（常含酚殘留）

操作時(shí)間 20-30分鐘 2-3小時(shí)

最大樣本量 5×10? cells或25 mg組織 需分多次處理

1.3 適用樣本類(lèi)型

推薦樣本：

? 培養(yǎng)細(xì)胞（貼壁/懸浮）

? 動(dòng)物組織（肝、脾等軟組織優(yōu)先）

? 血液（需配合紅細(xì)胞裂解步驟）

不推薦樣本：

? 植物組織（需專用試劑盒）

? 石蠟包埋樣本（需脫蠟預(yù)處理）

二、標(biāo)準(zhǔn)化操作流程

2.1 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

試劑預(yù)冷：Buffer AW1/AW2需4℃保存，使用前室溫平衡

樣本預(yù)處理：

復(fù)制

貼壁細(xì)胞：胰酶消化后PBS重懸  

組織樣本：液氮研磨至粉末狀  

2.2 詳細(xì)操作步驟

復(fù)制

1. 裂解：  

   - 加20 μL蛋白酶K + 200 μL Buffer ATL  

   - 56℃孵育10分鐘（組織需延長(zhǎng)至30分鐘）  

2. 結(jié)合：  

   - 加200 μL Buffer AL + 200 μL乙醇（96-100%）  

   - 渦旋混勻15秒  

3. 過(guò)柱：  

   - 轉(zhuǎn)移混合液至離心柱，≥6000 g離心1分鐘  

4. 洗滌：  

   - 加500 μL Buffer AW1，離心1分鐘  

   - 加500 μL Buffer AW2，離心3分鐘（確保去鹽）  

5. 洗脫：  

   - 加50-100 μL Buffer AE，室溫靜置5分鐘后離心  

2.3 關(guān)鍵優(yōu)化點(diǎn)

提高得率：

延長(zhǎng)組織裂解時(shí)間至2小時(shí)

二次洗脫（使用同一洗脫液）

提高純度：

增加AW2洗滌離心至5分鐘

洗脫前空離2分鐘去除殘留乙醇

三、質(zhì)量評(píng)估與問(wèn)題排查

3.1 質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)

純度合格：A260/A280=1.7-1.9，A260/A230>2.0

完整性驗(yàn)證：

? 0.8%瓊脂糖凝膠電泳，主帶>10 kb（無(wú)拖尾）

? 適用于PCR、Southern blot等下游應(yīng)用

3.2 常見(jiàn)問(wèn)題診斷

現(xiàn)象 可能原因 解決方案

得率低 /乙醇比例錯(cuò)誤 增加蛋白酶K用量/檢查乙醇濃度

A260/A280異常 蛋白質(zhì)或酚殘留 增加AW2洗滌步驟

DNA降解 樣本反復(fù)凍融/RNase污染 使用新鮮樣本/添加RNase抑制劑

3.3 應(yīng)用案例數(shù)據(jù)

案例1：小鼠尾尖基因分型

結(jié)果對(duì)比：

復(fù)制

Qiagen 51304：平均得率8.2 μg，PCR成功率98%  

CTAB法：平均得率5.1 μg，PCR成功率85%  

案例2：FFPE樣本提取

優(yōu)化方案：

增加蛋白酶K至40 μL，裂解過(guò)夜

得率提升3倍（從0.5 μg至1.5 μg/10 μm切片）

四、技術(shù)問(wèn)答（Q&A）

Q1：能否用于微量樣本（<10? cells）？

需配合 載體RNA（如Qiagen 1017456） 提高回收率（建議終濃度5 ng/μL）

Q2：洗脫緩沖液選擇建議？

Buffer AE：含EDTA，適合長(zhǎng)期儲(chǔ)存（-20℃）

無(wú)菌水：適用于立即使用的PCR等應(yīng)用

文檔優(yōu)化建議：

插入 【電泳檢測(cè)示例圖】 標(biāo)注完整性與降解DNA區(qū)別

添加 得率計(jì)算工具 二維碼（鏈接至在線計(jì)算器）

關(guān)鍵步驟用 ??注意 標(biāo)注（如"勿讓離心柱干燥"）